Genetske bolezni so še vedno globalni izziv, saj nastanejo zaradi mutacij v genih, ki vplivajo na biološke funkcije, presnovne procese ali proizvodnjo določenih esencialnih beljakovin posameznikov, do različnih dednih motenj. Zdravila za gensko terapijo so vrsta terapevtskega posega, ki je usmerjen na specifične gene, da bi jih popravil ali spremenil in zagotovil celicam nova navodila za proizvodnjo funkcionalnih beljakovin ali poseganje v okvare genov, ki povzročajo bolezni.
Običajna genska zdravila vključujejo predvsem DNK in RNK, kjer so DNK lahko genski fragmenti ali genska zaporedja s terapevtskimi učinki. Ta DNK se dostavi v celice, da nadomesti ali dopolni okvarjene ali manjkajoče genske funkcije. RNA je lahko sporočilna RNA (mRNA), mala interferenčna RNA (siRNA) ali protismiselni oligonukleotidi (ASO) itd., ki se lahko uporabljajo za spreminjanje, zaviranje izražanja škodljivih genov ali obnovitev delovanja specifičnih genov.
Vendar se tako DNK kot RNK soočata s številnimi izzivi od vstopa v človeško telo do doseganja ciljnih celic. Ker so genska zaporedja v prebavnem traktu nestabilna, se običajno dajejo z intravensko ali subkutano injekcijo, vendar kljub temu večino genskih zaporedij še vedno razgradijo obilne nukleaze v človeškem telesu.
Ko majhna količina ostankov genskih zdravil doseže zunanjost ciljnih celic, ne morejo vstopiti v celice, ker so genske sekvence velike molekule s fosfatnimi skupinami, ki nosijo negativne naboje, medtem ko celične membrane prav tako nosijo negativne naboje. Ko se srečata dva negativna naboja, se geni odbijejo in ne morejo vstopiti v celice. Zato moramo razviti specifične metode dostave genskih zdravil, da preprečimo njihovo razgradnjo in vivo in izboljšamo učinkovitost prodiranja v celično membrano ter nemoteno dostavimo zaporedja DNA ali RNA v celice.
Metode dostave genskih zdravil
Trenutne običajne metode dostave genov so v glavnem razdeljene v dve kategoriji: dostava virusnih vektorjev in dostava ne{0}}virusnih vektorjev. Dostava virusnih vektorjev vključuje predvsem adeno{2}}povezan virus (AAV) in lentivirus itd., ki lahko simulirajo proces virusne okužbe gostiteljskih celic in zlahka prečkajo celične ovire, s čimer dosežejo visoko učinkovitost dostave. Vendar ima dostava virusnega vektorja tudi težave: prvič, ima omejeno zmogljivost pakiranja, kot je največja zmogljivost pakiranja AAV 4,7 kb, ki ne more dostaviti daljših genskih zaporedij; drugič, virusni vektorji lahko povzročijo resne imunske reakcije, vključno s celično imunostjo in humoralno imunostjo, kar predstavlja tveganje za klinično uporabo. V primerjavi s tem imajo ne-virusni vektorji velike prednosti glede varnosti in zmogljivosti nalaganja zdravil.
Trenutno običajno uporabljeni ne{0}}virusni vektorji vključujejo predvsem liposome, polimere, nanodelce, eksosome itd., med katerimi so liposomi vezikli, ki jih tvorijo amfifilne molekule s premeri od 100 nm do 1 um. V glavnem so sestavljeni iz fosfolipidov, holesterola, lipidov PEG in kationskih lipidov. Fosfolipidna dvoslojna struktura je podobna celičnim membranam in lahko gladko vstopi v celice z endocitozo. Poleg tega lahko liposomi tudi spremenijo PEG ali specifična protitelesa na svojih površinah, da se izognejo imunskemu čiščenju telesa, medtem ko ciljajo na specifična tkiva ali celice. Kationski liposomi so liposomi, ki vsebujejo pozitivno nabite lipide kvarterne amonijeve soli, ki se lahko bolje vežejo z negativno nabitimi zdravili nukleinske kisline in ohranjajo stabilnost sistema za dostavo. Zato so liposomi ena od pogostih ne{9}}virusnih vektorskih metod dostave genskih zdravil.
Vendar pa imajo tradicionalni liposomi tudi nekaj težav: prvič, zaradi velikega razpona premerov liposomov, čeprav lahko to zagotovi zadostno zmogljivost nalaganja zdravila, ko liposomi prehajajo skozi žilno endotelno režo (100-200nm), bo prevelika velikost ovirala ta proces. Poleg tega, potem ko liposomi vstopijo v celice skozi endocitozo in tvorijo sistem endosom-lizosom, tradicionalni liposomi ne morejo pravočasno dokončati lizosomskega pobega, kar povzroči, da lizosomi razgradijo večino genskih zdravil in ne morejo izvajati svojih učinkov. Na podlagi teh pomanjkljivosti tradicionalnih liposomov pri dostavi genskih zdravil so bili razviti lipidni nanodelci (LNP), ki so postali pomembna metoda dostave, posebej primerna za dostavo nukleinskih kislin v ciljne celice in tkiva.
Uvod v nosilni sistem LNP
Lipidni nanodelci (LNP) so nanodelci, sestavljeni iz lipidom-podobnih snovi in premera na splošno med 10–200 nm. V primerjavi s tradicionalnimi liposomi so manjši in lažje prehajajo skozi vaskularne endotelijske reže. Poleg tega je LNP običajno sestavljen iz kationskih/ionizirajočih lipidov, pomožnih fosfolipidov, polietilen glikolnih (PEG) lipidov in holesterola. Med njimi lahko pomožni fosfolipidi in holesterol povečajo stabilnost LNP; Lipidi PEG pomagajo povečati čas kroženja LNP in vivo in zmanjšajo imunske reakcije. Te komponente imajo podobne funkcije kot tradicionalni liposomi. Razlika je v kationskih/ionizirajočih lipidih, ki so tudi glavno področje patentne zaščite za LNP.
Kot smo že omenili, lahko kationski liposomi učinkovito vzdržujejo vezavo z zdravili nukleinske kisline in izboljšajo učinkovitost dostave zdravil nukleinske kisline. Vendar pa so kationski liposomi tudi nagnjeni k ne-specifični vezavi z negativno nabitimi plazemskimi proteini, krvnimi celicami itd. v telesnem obtoku, kar povzroči agregacijo liposomov in se hitro odstranijo iz telesa (razpolovna-življenjska doba kationskih liposomov in vivo je samo 15 minut).
Za rešitev tega problema so raziskovalci razvili novo vrsto lipidnega materiala, imenovanega ionizirajoči lipidi. Ionizirajoči lipidi so po strukturi zelo podobni kationskim lipidom. Če za primer vzamemo običajni kationski lipid DOTAP in ionizirajoči lipid DODAP, je razlika v tem, da je DOTAP kvarterna amonijeva sol s pozitivnim nabojem, medtem ko je DODAP terciarna aminska struktura. Struktura terciarnega amina lahko ohrani pKa lipida med 6-7. Ko je pH nižji od pKa (v kislih pogojih), so ionizirajoči lipidi pozitivno nabiti.
Ko je pH blizu pKa (v nevtralnih pogojih), so ionizirajoči lipidi nevtralni. Ta zasnova lahko pametno reši težavo, s katero se srečujejo kationski liposomi: ker je pH v krvnem obtoku blizu nevtralnega, so nevtralni tudi lipidi, ki jih je mogoče ionizirati, in ne-specifična vezava med njimi in plazemskimi beljakovinami ali krvnimi celicami je znatno zmanjšana, kar podaljša razpolovno dobo. Poleg tega, ko celice prevzamejo ionizirajoče lipidne LNP in vstopijo v lizosome, so lipidi ionizirani in pozitivno nabiti v lizosomskem okolju s pH 5-6. Pozitivno nabiti lipidi se zlahka zlijejo z endosomsko-lizosomsko membrano, kar omogoči liposomom, da uidejo v citoplazmo, disociirajo in sprostijo nukleinske kisline ter tako izvajajo svoje učinke. Če povzamemo, oblikovanje nosilnega sistema LNP vključuje optimizacijo sestave lipidov, velikosti delcev, površinskega naboja in stabilnosti za doseganje učinkovite dostave genov.
Strategija bioanalize LCMS za genska zdravila, pakirana v LNP-
LNP{0}}zapakirana genska zdravila so večinoma sestavljena iz lupine LNP in samega genskega zdravila. Lupina LNP je v glavnem sestavljena iz lipidnih komponent (kationski/ionizirajoči lipidi predstavljajo približno 30-50 %, PEG lipidi predstavljajo približno 2 %, holesterol predstavljajo približno 20-50 %, pomožni fosfolipidi predstavljajo približno 10-20 %), medtem ko genska zdravila večinoma sestavljajo fragmenti genskega zaporedja (DNA, ASO, siRNA in miRNA itd.). V skladu z najnovejšimi predpisi NMPA in FDA[14-15] sta za IND uporabo zdravil sistema za dostavo zdravil, kot je LNP, poleg izvajanja farmakoloških in farmakokinetičnih študij o učinkovini (zaporedju genov) potrebna tudi varnost in farmacevtska ocena novih komponent lipidov, ki niso bile uporabljene v trženih zdravilih v sistemu za dostavo zdravil, kot so kationski/ionizabilni lipidi in lipidi PEG s posebnim spremembe v LNP.
Bioanaliza LCMS lipidov LNP se osredotoča na kationske/ionizirajoče lipide in lipide PEG. Zaradi strukturnih razlik med njimi je molekulska masa kationskih/ionizirajočih lipidov na splošno znotraj 1 kDa, medtem ko lahko molekulska masa PEG lipidov doseže 2~5 kDa po prenašanju modifikacijskih skupin, kar povzroči velike razlike v kromatografskem zadrževanju in odzivu masne spektrometrije med njimi. Glede na to, da je vsebnost kationskega/ionizirajočega lipida v LNP višja od vsebnosti PEG lipida, razlika v odzivu vodi do nezmožnosti učinkovitega poenotenja metod predobdelave (izbira ekstrakcijskega topila, določitev faktorja redčenja) obeh. Poleg tega je zaradi prisotnosti številnih motečih vrhov okoli položaja vrha lipida PEG za učinkovito ločevanje pogosto potreben daljši gradient ločevanja tekoče faze, kar ne more zagotoviti visoke učinkovitosti analize. Zato ločeno vzpostavljamo metodo detekcije lipidov PEG v bioanalizi. Hkrati imajo kationski/ionizirajoči lipidi in PEG lipidi tudi skupne težave pri razvoju metod zaradi svojih lipidnih komponent, kot so slaba topnost v vodi, nestabilnost v biološkem matriksu, vezava na beljakovine za obnovitev, ki presega mejo, visoka interferenca in ostanek PEG lipidov, sprememba stabilnosti lipidov v realnem vzorčnem matriksu in težave pri izbiri internega standarda.
